De hybridisering in situ är en metod för att upptäcka kromosomavvikelser. Vissa kromosomer är markerade med fluorescerande färgämnen och bundna till en DNA-sond. Denna teknik används för prenatal diagnos av genmutationer.
Vad är hybridisering in situ?
När det gäller hybridisering in situ eller Fluorescens in situ hybridisering nukleinsyror från RNA eller DNA detekteras i vissa vävnader eller en cell med användning av molekylärgenetiska metoder. Vanligtvis används denna typ av diagnos för att upptäcka en strukturell eller numerisk kromosomavvikelse under graviditeten.
För detta ändamål används en konstgjord tillverkad sond, som i sig själv består av nukleinsyra. Den binder sedan till nukleinsyrorna i organismen genom basparning. Denna bindning avses med termen hybridisering. Bevis baseras på patientens levande struktur och motsvarar därför bevis på plats. Detta ska särskiljas från in vitro-metoder där detekteringen sker i provröret. Metoden utvecklades under 1900-talet av forskarna Joe Gall och Mary Lou Pardue.
Tekniken har utvecklats sedan dess. Medan radioaktiva prober användes vid den tiden, till exempel, används fluorescensmärkta prober med en kovalent bindning till markörmolekylerna idag.
Funktion, effekt och mål
Hybridisering in situ används vanligtvis för att detektera kromosomavvikelser, dvs kromosomala avvikelser som inte kan detekteras i ett karyogram. Detta innebär att metoden alltid används när ärftliga sjukdomar ska bestämmas under graviditeten.
Eftersom kromosomavvikelser är ett problem som inte borde underskattas idag har användningen av metoden ökat över tid. Hybridisering sker på basis av infödda celler från moderns fostervatten. Grunden för tekniken är bindningen av den färgmärkta sonden till DNA-delar. Tack vare bindningen kan antalet kopior senare utvärderas med ett mikroskop, eftersom de enskilda kopiorna avger en ljussignal och således kan synliggöras under mikroskopet. Det finns olika förfaranden. Antingen sker analysen omedelbart efter bindning.
I detta fall används ett fluorescerande färgämne såsom biotin, som är bundet direkt till DNA-sonden. Med den indirekta metoden för in situ-hybridisering kan utvärderingen inte ske omedelbart efter hybridisering, eftersom fluorescerande substanser endast kan binda till sonden efter hybridisering. Denna indirekta metod används oftare än den direkta eftersom den tros vara mer känslig. Förutom kromosomspecifika DNA-sondrar med centrometer finns det också lokusspecifika DNA-prober, kromosomspecifika DNA-biblioteksonder och jämförande genomhybridiseringar.
Kromosomspecifika centrometer-DNA-prober kan användas för att detektera kromosomala numeriska avvikelser. Detta innebär att de främst används när det finns misstankar om duplicerade eller borttagna kromosomer. De platsspecifika DNA-proberna är särskilt lämpliga för detektering av minimala mutationer som inte kan detekteras i karyogrammet. En kromosomspecifik DNA-bibliotekssond används särskilt för att detektera insertioner och translokationer.
Jämförande genomhybridisering är å andra sidan en omfattande analys av förluster och vinster i kromosomalt material. Idag är hybridisering in situ mycket viktig vid diagnos av olika kromosommutationer.Vid diagnostik av Downs syndrom binder sondar till exempelvis kromosom 21. För detta ändamål används vanligtvis kromosomspecifika sönder, som kan användas om denna sjukdom misstänks.
En misstank kan uppstå, till exempel om föräldrarna tidigare har fött ett barn med sjukdomen och ultraljudsbilden är onormal. Om det finns en trippel istället för en dubbelbindning och därmed en trippelfärgsignal matas ut, anses diagnosen bekräftad.
Risker, biverkningar och faror
Till skillnad från till exempel PCR är hybridisering in situ signifikant mindre mottaglig för kontaminering. Dessutom är den tid som krävs för processen oerhört mindre. Eftersom embryon i synnerhet bildar kromosommönster, kan emellertid ett mönster inte användas för att bestämma resten av kromosomfördelningen och därmed andra cellers genetiska status.
Färgsignaler kan också överlappa varandra eller förbli osynliga av andra skäl. Som ett resultat är hybridisering in situ som ett diagnostiskt verktyg relativt benägen att fel under graviditeten. Misdiagnoser kan uppstå och föräldrar kan besluta mot ett friskt embryo. För att minska mottagligheten för fel vid hybridisering in situ bör minst två embryonala celler undersökas samtidigt. Genom att undersöka två celler parallellt finns det nu bara en försumbar risk för feldiagnos.
I sådant fall kan föräldrar absolut lita på diagnosen. Hybridisering på plats erbjuds inte varje gravid kvinna, utan endast till kvinnor från en riskgrupp. Trots detta nekas inte gravida kvinnor den här typen av diagnos på egen begäran. Onormala resultat av ultraljud eller ett onormalt serum kan få en läkare att erbjuda diagnosproceduren. Även om en stor del, men inte alls, kromosomavvikelser kan diagnostiseras med hjälp av in-situ hybridisering.
Därför får hybridisering in situ aldrig utföras ensam utan måste alltid användas i samband med ett konventionellt kromosomtest. Vård av den gravida kvinnan spelar en viktig roll i detta förfarande. Innan analysen pågår en välgrundad diskussion med den väntande modernen om den diagnostiska metoden, som förklarar riskerna, möjligheterna och gränserna för tekniken.
